Cпойлер
Микробиологическая диагностика. Материалом для лабораторного исследования служат носоглоточная слизь, смывы из носоглотки (в первые дни болезни) с целью обнаружения гриппозного вируса. Ретроспективный диагноз ставится при помощи реакции торможения гемагглютинации и реакции связывания комплемента для обнаружения антител в парных сыворотках больного.
Для получения смыва из носоглотки больному предлагают прополоскать зев 15 мл теплого физиологического раствора и полоскательный материал собирают в стерильную банку. В носовые ходы больного поочередно вводят пипеткой по 2—2,5 мл теплого физиологического раствора. При наклоне головы жидкость собирают в ту же банку. Носовые ходы протирают ватным тампоном, который также опускают в банку. Смывы фильтруют через вату для удаления крупных частиц.
У тяжелобольных и детей материал из зева собирают ватным тампоном, увлажненным стерильным бульоном. Носовые ходы протирают свежими тампонами, которые погружают в пробирку с 5 мл стерильного бульона. Если смывы пересылают в лабораторию, их консервируют глицерином или помещают в термос со льдом.
Перед посевом на 1 мл смыва добавляют (для подавления роста посторонней микрофлоры) 400 ЕД пенициллина и 0,4 мг стрептомицина, затем вводят его (0,1—0,2 мл) в амниотическую полость 11—12-дневных куриных эмбрионов. Зараженных куриных эмбрионов выдерживают в термостате в течение 72 часов при 35—36°, Для обнаружения вируса из эмбриона стерильно отсасывают 5—8 мл аллантоисной и 0,5—2 мл амниотической жидкости. Присутствие в них вируса обнаруживают с помощью реакции гемагглютинации. Реакцию гемагглютинации можно поставить на предметном стекле и в пробирках. На обезжиренном предметном стекле смешивают каплю аллантоисной жидкости с каплей 5% взвеси эритроцитов курицы или морской свинки. Агглютинация эритроцитов наступает через 2—3 минуты.
Опыт в пробирках ставят следующим образом. Аллантоисную жидкость разводят физиологическим раствором 1 : 10, далее разведение удваивают (1 : 20, 1 : 40, 1 : 80 и 1 : 160), как видно из табл. 28.
Затем во все пробирки добавляют по 0,5 мл эритроцитов курицы. Учет реакции производят через 30—45 минут стояния пробирок при комнатной температуре. В контрольной (6-й) пробирке агглютинации эритроцитов не будет.
Для выращивания вируса гриппа в культуре ткани из пробирок, содержащих монослой клеток, отсасывают питательную среду, 2—3 раза отмывают раствором Хэнкса или другим солевым раствором и вместо нее вносят 0,1—0,2 мл носоглоточного смыва. После контакта в течение 1 часа добавляют 1 мл питательной среды или раствора Хэнкса. Через 2—5 дней стояния в термостате культуру микроскопируют и рост вируса определяют по цитопатогенному действию. Вирус гриппа не всегда оказывает такое действие на клетки, поэтому для его обнаружения ставят реакцию гемадсорбции, которая заключается в следующем. В пробирку с культурой ткани добавляют взвесь отмытых куриных эритроцитов, которые фиксируются на поверхности эпителиальных клеток, содержащих вирус, в виде гроздьев, розеток, что определяется микроскопически. Добавление типоспецифической сыворотки устраняет гемадсорбцию. Это дает возможность еще определить и тип вируса.
Тип выделенного вируса определяют с помощью реакции задержки гемагглютинации (РЗГА). Ее можно поставить на предметных стеклах и в пробирках. На предметные стекла наносят каплю выделенного вируса гриппа, типовые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5, 1 : 10, на первом стекле смешивают вирус с каплей противогриппозной сыворотки типа А, на втором — с противогриппозной сывороткой A1 и т. д. На седьмое стекло добавляют каплю нормальной сыворотки. Затем вносят на каждое предметное стекло третий ингредиент реакции — каплю 5% взвеси эритроцитов. Учет реакции производят через несколько минут. При смешивании вируса гриппа с соответствующей типоспецифической сывороткой реакция агглютинации не наступает, что объясняется нейтрализацией вируса.
Реакция связывания комплемента ставится для обнаружения антител в сыворотке крови больных. В последнем случае ее следует поставить в первые дни заболевания и повторно спустя несколько дней (для определения нарастания титра антител), так как в сыворотке многих людей имеется некоторое количество антител в результате ранее перенесенных заболеваний.
Биологическая проба ставится на мышах, которым под эфирным наркозом интраназально вводят 0,05—0,1 мл исследуемого материала. Через 2—4 дня у животных развивается пневмония, приводящая к гибели их в течение 1—2 суток.
Простым и вместе с тем ценным методом лабораторного исследования является изготовление препаратов отпечатков (со слизистой оболочки нижней раковины), на которые наносят каплю флюоресцирующей сыворотки. Обнаружение при такой экспресс-диагностике через несколько часов специфического зеленовато-желтого свечения в клетках цилиндрического эпителия слизистой оболочки носа подтверждает присутствие вируса гриппа.
